Adaptação e avaliação da técnica de citometria de fluxo para detecção de corpos de Heinz

INTRODUÇÃO: Corpos de Heinz são inclusões presentes nos eritrócitos, resultado de hemoglobinas instáveis e podem estar presentes em amostras de pacientes portadores de hemoglobinopatias. O método usado atualmente utiliza microscopia óptica, é pouco sensível e raramente utilizado. O composto acetilfenilhidrazina induz a produção de corpos de Heinz fluorescentes. O objetivo deste trabalho foi adaptar e avaliar a técnica de citometria de fluxo para detectar os corpos de Heinz induzidos in vitro por acetilfenilhidrazina. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram utilizadas amostras de sangue de controles normais, alfa-talassêmicos e portadores de síndromes falciformes que foram incubadas com acetilfenilhidrazina e analisadas por citometria de fluxo. As emissões médias de fluorescência (mean fluorescence intensity – MFI) foram comparadas com os resultados obtidos na eletroforese de hemoglobina e no hemograma. RESULTADOS: Foram padronizadas a estabilidade das amostras e a quantidade de amostra necessária para a realização da técnica. Dentre os índices hematológicos, houve correlação positiva entre MFI e VCM, HCM e CHCM. Os pacientes portadores de síndromes falciformes obtiveram emissões médias de fluorescência significativamente mais altas que os controles e os alfa-talassêmicos e houve correlação positiva entre o aumento da emissão de fluorescência e a presença de HbS. Para os alfa-talassêmicos, não foi encontrada diferença significativa na emissão de fluorescência com relação aos controles normais. CONCLUSÃO: Foi possível padronizar a técnica de citometria de fluxo para detecção dos corpos de Heinz induzidos por acetilfenilhidrazina em pacientes alfa-talassêmicos e portadores de síndromes falciformes. Futuras análises precisam esclarecer a correlacão entre a produção de corpos de Heinz e a severidade de crises oxidativas em pacientes alfatalassêmicos e a relação entre a emissão média de fluosrescência obtida na citometria com o mecanismo de formação de corpos de Heinz pela acetilfenilhidrazina.INTRODUCTION: Heinz bodies are inclusions present in red blood cells, which is the result of precipitated unstable hemoglobins. It can be found in samples of patientes who have hemoglobinopathies. The currently method for Heinz bodies visualization use optical microscopes which has lack of sensitivity and is rarely used. The compound acetylphenylhydrazine induce the production of fluorescents Heinz bodies. The main aim of the current study was to evaluate and adapt the flow cytometry technique to detect the fluorescent Heinz bodies induced in vitro by acetylphenylhydrazine. METHODS: Whole blood-samples from normal controls, patients with alpha thalassemia and syckle cell disease were incubated with acetylphenylhydrazine and examined by flow cytometry. The mean fluorescence intensity (MFI) was compared with the results of hemogram and hemoglobin eletrophoresis. RESULTS: It was standardize the stability and the amount of sample needed to perform this technique. Amongst the hematologic parameters, it was found positive correlation between MFI and VCM, HCM and CHCM. The patients with syckle cell disease had significantly higher MFI than controls and alpha thalassemic patients. Also, we found positive correlation between MFI and HbS. In the alpha thalassemia group, no significantly difference in MFI was found when compared to control samples. CONCLUSION: It was possible to detect fluorescent Heinz bodies induced by acetylphenylhydrazine by flow cytometry in alpha thalassemic and sickle cell disease patients. Further analyses are necessary to evaluate the correlation between Heinz bodies and the severity of oxidative crisis in alpha thalassemic patients and between MFI with the mechanism of Heinz bodies production by acetylphenylhydrazine

Avaliação dos atrasos de diagnóstico e tratamento de leucemias nas regiões de saúde do Rio Grande do Sul

Introdução: As leucemias são importantes causas de morbidade e mortalidade e figuram entre os principais tipos de câncer no país e no mundo. Os intervalos de tempo entre uma etapa do cuidado a outro, definidos como atrasos, podem ser importantes indicadores da resposta do Sistema de Saúde no enfrentamento das leucemias. Objetivo: Comparar os atrasos de diagnóstico e tratamento das leucemias nas diferentes Regiões de Saúde no Rio Grande do Sul (RS) entre os anos de 2015 e 2019. Métodos: Emprego de dados do banco de Registros Hospitalares de Câncer (RHC) do INCA (n=982), avaliando-se dois atrasos: atraso de diagnóstico (tempo decorrido entre a primeira consulta com o serviço responsável pelo seu tratamento até a data do primeiro diagnóstico) e atraso de tratamento (intervalo de tempo entre o primeiro diagnóstico e a data do início do primeiro tratamento específico para o tumor). Resultados: Do total de casos, 553 (56,3%) eram homens, com média de idade de 44,4 anos. A maioria tinha idade entre 18 e 59 anos, 373 (38%). A mediana encontrada para ambos os atrasos foi 3 dias, sem diferença no atraso de diagnóstico (p=0,199) e de tratamento (p=0,314) entre os sexos. Houve diferença significativa tanto no atraso de diagnóstico quanto de tratamento entre as diferentes Regiões de Saúde. O atraso de diagnóstico também foi maior nos casos oriundos do SUS em comparação aos casos não oriundos do SUS e os encaminhados por conta própria. Foram encontrados maiores atrasos de diagnóstico e de tratamento, tanto nos adultos (entre 18 e 59 anos), quanto nos maiores de 60 anos, em comparação com crianças (0 a 11 anos) e adolescentes (12 a 17 anos). E os estabelecimentos pertencentes à Rede de Atenção Onco-Hematológica do Estado foram capazes de diagnosticar e tratar pacientes em intervalos menores que os estabelecimentos não participantes dela. Conclusão: Foram encontradas diferenças significativas tanto no atraso de diagnóstico quanto de tratamento de leucemias entre as diferentes Regiões de Saúde do RS no período de 2015 a 2019. Os achados deste estudo podem contribuir na avaliação da qualidade do serviço prestado e atuar como indicadores para os gestores públicos.Introduction: Leukemia is an important cause of morbidity and mortality, being one of the primary causes of cancer in Brazil and worldwide. The periods between differents stages of care pathway, know as delays, can be important indicators to quality of the Health System's response in cases of leukemia. Objective: To compare diagnosis and treatment delays for leukemia across the differents Health Regions in Rio Grande do Sul (RS) between 2015 and 2019. Methods: We assessed data from the INCA hospital-based cancer records (RHC) database (n=982), evaluating two delays: diagnosis delay (time interval between the first medical contact with the service responsible for treatment until the date of the first diagnosis) and treatment delay (time interval between the first diagnosis and first tumor-specific treatment). Results: Of the total cases, 553 (56.3%) were men, with a mean age of 44.4 years. Also, most cases had between 18 and 59 years of age, 373 (38%). The median found for both delays was 3 days. There was no significant difference in delay diagnosis (p = 0.199) or delay treatment (p=0.314) between genders. There was a significant difference in both diagnosis and treatment delay among the different Health Regions. The diagnosis delay was longest in cases originating from SUS. Longest delays in diagnosis and treatment were found, both in adults (18 to 59 years old) and in those over 60 years old, compared to children (0 to 11 years old) and adolescents (12 to 17 years old). The hospitals that are part of the Onco-Hematological Care Network could diagnose and treat patients with leukemia in shorter intervals than those that are not part of it. Conclusions: Significant differences were found both in diagnosis and treatment delays of leukemia among the different Health Regions of the state of Rio Grande do Sul in the period from 2015 to 2019. The findings of our study contribute to the assessment of the quality of the service provided and act as indicators for public managers

Comparación de técnicas para contar procariotas en muestras de biofilm y plancton marino

Though a large number of techniques are available for the study of aquatic bacteria, the aim of this study was to establish a technique for analysing free-living and biofilm prokaryotic cells through laboratory assays. In particular, we wished to analyse the efficiency of ultrasound to detach and disrupt biofilm, to obtain an efficient stain treatment for quantifying free-living and biofilm prokaryotes in flow cytometry (FC), and to compare epifluorescence microscopy (EFM), scanning electron microscopy (SEM) and FC for quantifying free-living and biofilm prokaryotes#. Marine-grade plywood substrates were immersed in natural marine water that was conditioned for 12 days. At 6 and 12 days, water aliquots and substrates were removed to estimate free-living and biofilm prokaryote density. Ultrasound efficiently removed marine biofilm from substrates (up to 94%) without cell damage. FC analysis (unstained) reliably quantified marine plankton and young or mature biofilm prokaryotes compared with other staining (acridine orange, 4′,6-diamidino-2-phenylindole, propidium iodide and green fluorescent nucleic acid), EFM or SEM techniques. FC and SEM achieved similar results, while a high variability was observed in the EFM technique. FC was faster and more precise than SEM because the count is not dependent on the observer.A pesar de la gran cantidad de técnicas disponibles para el estudio de bacterias acuáticas, el objetivo de este estudio fue aplicar y proponer una técnica para el análisis de células procariotas de vida libre y asociado a biofilms en ensayos de laboratorio. En particular, deseamos analizar la eficiencia de de la aplicación de ultrasonidos para separar y romper el biofilm, obtener un tratamiento de tinción eficiente para cuantificar procariotas de vida libre y de biofilm por citometría de flujo (CF), y comparar microscopía de epifluorescencia (MEP), microscopía electrónica de barrido (MEB) y CF para cuantificar los procariotas de vida libre y de biofilm. Los sustratos de madera contrachapada de grado marino se sumergieron en agua marina natural que se acondicionó durante 12 días. A los 6 y 12 días, se retiraron alícuotas de agua y sustratos para estimar la densidad de procariotas de vida libre y asociados a los biofilms. Los ultrasonidos eliminaron de manera eficiente el biofilm marino de los sustratos (hasta 94%) sin dañar las células. El análisis por CF (sin marcador) cuantificó de manera fiable las células del plancton marino y los procariotas de biofilms jóvenes o maduros en comparación con otras técnicas de marcación (naranja de acridina, 4’, 6-diamidino-2-fenilindol, yoduro de propidio, ácido nucleico fluorescente verde), MEP o MEB. CF y MEB lograron resultados similares, mientras que se observó una alta variabilidad en la técnica EFM. Cuando se compara, CF es más rápido y más preciso que MED, ya que el recuento no depende del observador

Comparación de técnicas para contar procariotas en muestras de biofilm y plancton marino

Though a large number of techniques are available for the study of aquatic bacteria, the aim of this study was to establish a technique for analysing free-living and biofilm prokaryotic cells through laboratory assays. In particular, we wished to analyse the efficiency of ultrasound to detach and disrupt biofilm, to obtain an efficient stain treatment for quantifying free-living and biofilm prokaryotes in flow cytometry (FC), and to compare epifluorescence microscopy (EFM), scanning electron microscopy (SEM) and FC for quantifying free-living and biofilm prokaryotes#. Marine-grade plywood substrates were immersed in natural marine water that was conditioned for 12 days. At 6 and 12 days, water aliquots and substrates were removed to estimate free-living and biofilm prokaryote density. Ultrasound efficiently removed marine biofilm from substrates (up to 94%) without cell damage. FC analysis (unstained) reliably quantified marine plankton and young or mature biofilm prokaryotes compared with other staining (acridine orange, 4′,6-diamidino-2-phenylindole, propidium iodide and green fluorescent nucleic acid), EFM or SEM techniques. FC and SEM achieved similar results, while a high variability was observed in the EFM technique. FC was faster and more precise than SEM because the count is not dependent on the observer.A pesar de la gran cantidad de técnicas disponibles para el estudio de bacterias acuáticas, el objetivo de este estudio fue aplicar y proponer una técnica para el análisis de células procariotas de vida libre y asociado a biofilms en ensayos de laboratorio. En particular, deseamos analizar la eficiencia de de la aplicación de ultrasonidos para separar y romper el biofilm, obtener un tratamiento de tinción eficiente para cuantificar procariotas de vida libre y de biofilm por citometría de flujo (CF), y comparar microscopía de epifluorescencia (MEP), microscopía electrónica de barrido (MEB) y CF para cuantificar los procariotas de vida libre y de biofilm. Los sustratos de madera contrachapada de grado marino se sumergieron en agua marina natural que se acondicionó durante 12 días. A los 6 y 12 días, se retiraron alícuotas de agua y sustratos para estimar la densidad de procariotas de vida libre y asociados a los biofilms. Los ultrasonidos eliminaron de manera eficiente el biofilm marino de los sustratos (hasta 94%) sin dañar las células. El análisis por CF (sin marcador) cuantificó de manera fiable las células del plancton marino y los procariotas de biofilms jóvenes o maduros en comparación con otras técnicas de marcación (naranja de acridina, 4’, 6-diamidino-2-fenilindol, yoduro de propidio, ácido nucleico fluorescente verde), MEP o MEB. CF y MEB lograron resultados similares, mientras que se observó una alta variabilidad en la técnica EFM. Cuando se compara, CF es más rápido y más preciso que MED, ya que el recuento no depende del observador